nuacht

Is analóg de shubstráit β-galactosidase é IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactosidase), atá thar a bheith inducible.Faoi ionduchtú IPTG, is féidir leis an ionduchtóir coimpléasc a dhéanamh leis an próitéin repressor , Ionas go n-athraítear comhdhéanamh an phróitéin repressor, ionas nach féidir é a chomhcheangal leis an spriocghéine, agus cuirtear an spriocghéine in iúl go héifeachtach.Mar sin, conas ba cheart an tiúchan IPTG a chinneadh le linn an turgnaimh?An amhlaidh is fearr an mó?
Gcéad dul síos, déanaimis prionsabal an ionduchtaithe IPTG a thuiscint: tá trí ghéinte struchtúracha, Z, Y, agus A, i lachtós operon (eilimint) E. coli, a ionchódaíonn β-galactosidase, permease, agus acetyltransferase, faoi seach.hidrealaíonn lacZ lachtós ina ghlúcós agus ina ghalachtós, nó ina aló-lachtós;Ligeann lacY do lachtós sa chomhshaol dul tríd an scannán cille agus dul isteach sa chill;aistríonn lacA an grúpa aicéitil ó acetyl-CoA go β-galactoside, rud a bhaineann le héifeacht Tocsaineach a bhaint.Ina theannta sin, tá seicheamh oibriúcháin O, seicheamh tosaigh P agus géine rialála I. Is é an cód géine I ná próitéin athbhrúite a fhéadfaidh ceangal a dhéanamh le seasamh O an t-ord oibreora, ionas go mbeidh an operon (meta) faoi chois agus múchta.Tá suíomh ceangailteach ann freisin do shuíomh ceangailteach próitéine-CAP gníomhachtaithe géine catabólach in aghaidh an tsrutha ón seicheamh tionscnaimh P. Is ionann an seicheamh P, an t-ord O agus an suíomh ceangailteach CBT le chéile agus an réigiún rialála den lac operon.Tá géinte códaithe na dtrí einsím á rialú ag an réigiún rialála céanna chun léiriú comhordaithe táirgí géine a bhaint amach.

In éagmais lachtós, tá an lac operon (meta) i stát faoi chois.Ag an am seo, ceanglaíonn an t-athbhrúiteoir lac a chuireann an seicheamh I in iúl faoi rialú an t-ord tionscnóra PI leis an seicheamh O, rud a chuireann cosc ​​ar RNA polymerase a cheangal leis an seicheamh P agus a chuireann cosc ​​ar thionscnamh trascríobh;nuair a bhíonn lachtós i láthair, is féidir an lac operon (meta) a tharlú Sa chóras operon (meta) seo, ní lachtós é an fíor-ionduchtóir.Téann lachtós isteach sa chill agus déantar é a chatalú le β-galactosidase chun é a thiontú go allolactós.Ceanglaíonn an dara ceann, mar mhóilín ionduchtóra, leis an próitéin athbhrúiteora agus athraíonn sé an comhfhoirmiú próitéine, rud a fhágann go ndéantar an próitéin athbhrúite a dhícheangal ón seicheamh O agus an trascríobh.Tá an éifeacht chéanna ag Isopropylthiogalactose (IPTG) agus allolactose.Is ionduchtóir an-chumhachtach é, nach bhfuil meitibileacht ag baictéir agus tá sé an-chobhsaí, agus mar sin úsáidtear go forleathan é i saotharlanna.

Conas an tiúchan is fearr de IPTG a chinneadh?Tóg E. coli mar shampla.
Rinneadh an brú E. coli BL21 a ndearnadh innealtóireacht ghéiniteach air ina raibh an pGEX athchuingreach dearfach (CGRP/msCT) a ionaclú isteach i meán leachtach LB ina raibh 50μg · ml-1 Amp, agus saothraíodh é thar oíche ag 37°C.Rinneadh an cultúr thuas a ionaclú i 10 mbuidéil de mheán leachtach úr LB 50ml ina bhfuil 50μg·mL-1 Amp ag cóimheas 1:100 le haghaidh cultúr leathnaithe, agus nuair a bhí luach OD600 0.6 ~ 0.8, cuireadh IPTG leis an tiúchan deiridh.Is é 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Tar éis an ionduchtaithe ag an teocht chéanna agus ag an am céanna, tógadh 1 mL den réiteach baictéarach uaidh, agus bailíodh na cealla baictéaracha trí lártheifneoiriú agus cuireadh faoi réir SDS-PAGE chun anailís a dhéanamh ar thionchar na dtiúchan IPTG éagsúla ar léiriú próitéin, agus ansin roghnaigh an tiúchan IPTG leis an abairt próitéine is mó.
Tar éis turgnaimh, gheobhaidh sé amach nach bhfuil an tiúchan IPTG chomh mór agus is féidir.Tá sé seo toisc go bhfuil tocsaineacht áirithe ag IPTG do bhaictéir.Beidh níos mó ná an tiúchan a mharú freisin na cille;agus ag labhairt go ginearálta, tá súil againn go bhfuil an próitéin níos intuaslagtha in iúl sa chill, is amhlaidh is fearr, ach i go leor cásanna nuair a bhíonn an tiúchan IPTG ró-ard, beidh cuid mhór cuimsiú a fhoirmiú.Comhlacht, ach tháinig laghdú ar an méid próitéine intuaslagtha.Mar sin, is minic nach bhfuil an tiúchan IPTG is oiriúnaí, is amhlaidh is fearr, ach is ísle an tiúchan.
Is é an cuspóir atá le hionduchtú agus saothrú tréithchineálacha a ndearnadh innealtóireacht ghéiniteach orthu ná táirgeacht na spriocphróitéine a mhéadú agus costais a laghdú.Ní hamháin go mbíonn tionchar ag fachtóirí an strain féin agus an abairt plasmid ar léiriú an spriocghéine, ach freisin ag coinníollacha seachtracha eile, mar shampla tiúchan an ionduchtóra, an teocht ionduchtaithe agus an t-am ionduchtaithe.Dá bhrí sin, go ginearálta, sula gcuirtear próitéin anaithnid in iúl agus a íonú, is fearr staidéar a dhéanamh ar an am ionduchtaithe, teocht agus tiúchan IPTG chun na coinníollacha cuí a roghnú agus na torthaí turgnamhacha is fearr a fháil.